皮影文物作为中国非物质文化遗产的核心组成部分，目前也正在遭受微生物降解的威胁。本研究以成都中国皮影博物馆馆藏皮影为研究对象，运用扫描电子显微镜（SEM）与高通量测序技术（NGS）对皮影表面存在的微生物进行了分析，检测发现皮影表面存在多种微生物，包括曲霉属（Aspergillus）、链霉菌属（Streptomyces）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、假单胞菌属（Pseudomonas）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）等多个类群。研究共分离得到11种微生物，其中4种为优势菌株，分别为假单胞菌WH. S-B1（Pseudomonas sp. WH. S-B1）、链霉菌WH. S-B2（Streptomyces sp. WH. S-B2）、拟诺卡氏菌WH. S-B6（Nocardiopsis sp. WH. S-B6）及烟曲霉WH. S-F2（Aspergillus fumigatus WH. S-F2）。值得注意的是，这4种菌株均表现出了胶原蛋白降解能力。本研究通过对皮影文物表面存在的微生物病害进行分析，为皮影文物的保护提供了理论依据。文章已经在线发表于Frontiers in Microbiology期刊2025年第16期。

1. 皮影表面微生物调查与取样

2022年10月和2023年3月，对中国皮影博物馆库房内保存的皮影文物开展了微生物调查与取样。这些皮影样本均以牛皮为原料制作而成，来源于多个农村地区，主要包括陕西、四川和河北。大多数皮影的年代跨度从民国时期到现当代。研究发现部分文物表面存在一定的微生物定殖现象（图1）。为评估微生物降解的严重程度，研究基于菌落覆盖面积建立了分级体系：样本S1-S5被归类为微生物轻度污染，S6-S10为微生物中度污染，S11-S16为微生物重度污染。研究人员使用无菌棉签采集皮影表面的微生物菌斑，随后将其划线接种到PDA培养基、LB培养基和高氏一号培养基平板上，这些平板在实验室进行后续的微生物分离与纯化。同时，无损获取表面菌斑，放入无菌EP管中，样本经干冰运输至实验室后，于-80℃条件下保存，以备后续的扩增子测序和宏基因组分析使用。调查期间，库房内的环境温度为18℃，相对湿度为56%。

图1. 皮影文物上的微生物菌斑。S1-S5为轻度污染，S6-S10为中度污染，S11-S16为重度污染。

2. 实验结果与分析

SEM分析为微生物菌丝和孢子的存在提供了确凿证据（图2）。值得注意的是，在多个样本（包括S1、S2、S7和S14）中同时检测到了真菌和放线菌。这一发现表明，皮影文物表面存在多样的微生物群落。这些结果有力地说明，文物上可见的微生物菌落是多种微生物协同作用的结果，而非单一生物的生长所致。除微生物结构外，扫描电子显微镜图像还显示皮影表面存在昆虫。这些昆虫在皮影上爬行时，可能会无意中携带微生物菌丝和孢子，从而促进微生物的传播并加剧对这些文物的污染。这种生物间的相互作用对皮影文物的长期保存构成了重大威胁。

图2. 皮影文物表面样本的扫描电子显微镜观察结果。

对样本S1-S16的高通量测序分析揭示了其存在多样的微生物群落。在这些文物表面，优势类群为子囊菌门（Ascomycota）真菌和放线菌门（Actinobacteria）细菌。具体而言，在样本S1-S5的原核生物群落中，厚壁菌门（Firmicutes）占比14.22%；样本S6-S10的原核生物中，变形菌门（Proteobacteria）占比30.68%；样本S11-S16的总微生物中，假单胞菌门（Pseudomonadota）占比5.05%。不同皮影文物的优势微生物群落存在差异，样本S1-S5具有相似的微生物组成，优势属为曲霉属（Aspergillus，真菌）和链霉菌属（Streptomyces，细菌）（图3A、C）。相比之下，样本S6-S10呈现出明显的差异：S6中曲霉属和假单胞菌属（Pseudomonas）占比较高；S7中假单胞菌属为优势属；S8的特征是曲霉属、微囊菌属（Microascus）、假单胞菌属和诺卡氏菌属（Nocardia）共存；S9中曲霉属、链霉菌属和假单胞菌属的丰度较高；S10则以曲霉属、蛛孢菌属（Arachnomyces）和链霉菌属为主（图3B、D）。对样本S11-S16的宏基因组测序进一步发现其群落以原核生物为主，关键分类代表包括拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、链霉菌属、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、短杆菌属（Brevibacterium）和Brachybacterium（图4）。这些发现凸显了皮影文物所关联的复杂多样的微生物生态系统，这可能对其保护与保存工作具有重要意义。

图3.皮影文物表面微生物的相对丰度。

（A）真核生物，样品S1-S5;（B）真核生物，样品S6-S10;

（C）原核生物，样品S1-S5;（D）原核生物，样品S6-S10。

图4.样品S11-S16表面微生物属水平的相对丰度。

为了阐明皮影文物上微生物的潜在降解机制，在多个数据库中对测序结果进行了注释。使用京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 数据库进行的分析表明，代谢途径在每个样本中占很大比例，跻身主要功能类别之列。这一发现强调了代谢功能在这些微生物群落中的关键作用（图5A)。基于eggNOG数据库的功能注释表明，虽然不同样品的功能类别的总体组成存在一定程度的相似性，但观察到特定比例的显着变化。转录、氨基酸转运、代谢和相关类别在多个样本中始终高度代表。例如，在样品S11中，未知功能的类别最为丰富，其次是转录、氨基酸转运和代谢。相比之下，样品S12显示出碳水化合物转运和代谢、无机离子转运和代谢等比例升高（图5B)。对综合抗生素耐药性数据库 （CARD） 的检查显示，抗生素耐药基因的相对丰度和组成存在显着差异。样品S13表现出最高的相对丰度，主要归因于vanI簇中的vanW基因（药物类别：糖肽抗生素）、vanO簇中的vanX基因（药物类别：糖肽抗生素）和vanA簇中的vanY基因（药物类别：糖肽抗生素）等基因。样品S15的相对丰度也相对较高，基因组成复杂，包括aadA5（药物类别：氨基糖苷类抗生素）等基因。相比之下，样品S11、S12和S16的相对丰度较低，其特征是基因成分分散且比例较小。样品S14显示出中等的相对丰度，主要由vanG簇中的vanY基因等基因组成（药物类别：糖肽抗生素）。这些结果说明了抗生素耐药基因在样本中的不同分布模式，为理解这些基因在不同环境背景下的传播和进化提供了重要数据（图5C)。

图 5.各功能标注的数据库标注结果

（A）宏基因组测序中KEGG数据库在1级的相对丰度;（B）宏基因组测序中1级的eggNOG数据库相对丰度;（C）宏基因组测序中CARD数据库的相对丰度。

使用微生物纯培养技术成功分离和纯化了 11 种不同的微生物物种，包括 4 种细菌菌株、2 种放线菌菌株和 5 种真菌分离株（表1）。其中，四种菌株：假单胞菌属 （WH. S-B1）、链霉菌属 （WH. S-B2）、假诺卡氏菌属（WH. S-B6） 和烟曲霉属 （WH. S-F2）与高通量测序数据吻合，表明它们是皮影文物上的主要病害微生物（图6）。因此，选择了这四种菌株进行进一步深入研究。在以明胶作为唯一氮源的培养基上的生长测定表明，假单胞菌属、链霉菌属、假诺卡氏菌属和烟曲霉属能够利用明胶进行生长（图7）。表明这四种菌株具有降解胶原蛋白的代谢潜力，胶原蛋白是皮影的主要结构蛋白成分。这些结果为皮影文物劣化的生化机制提供了重要的见解。

表 1.从皮影文物中分离出的菌株的分子鉴定结果

图6.四种微生物在培养基上和显微镜下的形态

（A） 假单胞菌属，WH. S-B1，LB 培养基;（B） 链霉菌属，WH. S-B2，高氏 1 号培养基;（C） 假诺卡氏菌属，WH. S-B6，高氏1 号培养基;（D）烟曲霉，WH.S-F2，PDA培养基;（E） WH. S-B1;（F） WH. S-B2;（G） Wh. S-B6;（H） WH. S-F2。

图7.明胶培养基上的四种微生物

（A） 假单胞菌属，WH. S-B1;（B） 链霉菌属，WH. S-B2;（C） 假诺卡氏菌属， WH. S-B6;（D） 烟曲霉，WH. S-F2。

发表信息：Wang Y, Wang Y, Guan Z, Wang Z, Duan Y, Min C, Zhong Y, Hou L and Pan J (2025). Analysis and prevention of microbial degradation of shadow puppetry artifacts preserved in the National Shadow Puppetry Museum in Chengdu. Front. Microbiol. 16:1611451. doi: 10.3389/fmicb.2025.1611451

本研究得到了国家重点研发计划（2022YFF0904100）和北京科技大学中央高校基本科研业务费的资助。

作者简介

王宇，北京科技大学科技史与文化遗产研究院，博士研究生

王媛媛，北京科技大学科技史与文化遗产研究院，硕士研究生

官之谦，北京科技大学科技史与文化遗产研究院，硕士研究生

王泽奥，北京科技大学科技史与文化遗产研究院，硕士研究生

段杨波，成都博物馆，文博研究馆员

闵晨，成都博物馆，文博馆员

钟雨晗，成都博物馆，文博助理馆员

侯立龙，南开大学生命科学学院，硕士研究生

潘皎，北京科技大学科技史与文化遗产研究院，教授